本生大課堂——ELISA實驗可能出現(xiàn)的問題及原因分析

　　1.應(yīng)該注意試劑4°c冷藏時水化層形成，蛋白分子分布異常;

　　2.標(biāo)本由于冷藏時Ig G聚合成多聚體，F(xiàn)ib非特異性吸附，反復(fù)凍融機械切力致使蛋白分子受損;

　　3.加樣時不準(zhǔn)，槍頭吸樣時插入樣本液面下2mm為宜;

　　4.常采用的溫度有43、37°c、室溫、或者4°c等。37°c常用，4°c效果好，但孵育時間有異;

　　5.要注意內(nèi)源如風(fēng)濕因子，補體，高濃度非特異性免疫球蛋白，異嗜性抗體及某些自身抗體等;外源如標(biāo)本溶血，細菌污染，儲存時間過長及凝固等因素影響。

　　6、在使用ELISA試劑盒時應(yīng)注意：2-8℃保存(特殊情況除外)、同一品種不同批號試劑不能混用、不同品種試劑盒顯色劑不能混用。

　　常見問題及分析

　　1、陽性對照不顯色

　　漏加陽性對照

　　陽性對照孔忘加酶或忘加顯色劑

　　陽性對照受污染

　　2、陽性對照顯色淺(HBeAb HBcAb陰性對照顯色淺)

　　試劑和保存不當(dāng)、活性下降

　　在使用前試劑盒未放置在室溫平衡

　　溫育時間不夠或孵育溫度過低

　　洗板浸泡時間過長、洗板次數(shù)過多

　　使用不正確的洗液

　　洗液中含有防腐劑同時殘留量過多

　　洗板后酶標(biāo)板被干透

　　讀數(shù)時使用波長不正確

　　濾光片不清潔或濾光片位置錯誤

　　讀數(shù)時酶標(biāo)板放置位置錯誤

　　陽性對照活性下降

　　酶標(biāo)失活

　　3、陰性對照顯色(HBeAb、HBcAB除外)

　　實驗過程受污染

　　陰性對照污染

　　酶滴在孔壁上

　　4、整板不顯色

　　試劑和保存不當(dāng)、已經(jīng)失活

　　忘記加酶、可檢查滴瓶內(nèi)酶量

　　忘記加抗原或中和試劑

　　忘記加顯色劑A或顯色劑B

　　5、陽性對照讀數(shù)不正常

　　加入標(biāo)本后未進行必要的混勻

　　標(biāo)本稀釋錯誤

　　加樣量不正確

　　冷凍標(biāo)本未溶解混勻

　　標(biāo)本中含有防腐劑

　　6、血清本底高

　　試劑盒靈敏度高

　　加樣時使用同一槍頭、交叉污染

　　孵育時間過長或溫度過高

　　洗板次數(shù)不足，浸泡時間短

　　洗板時洗液量少或殘留量多

　　洗板時洗液量過多、串孔

　　洗板機管道中有霉菌生長

　　洗液瓶混用

　　洗板機洗板頭阻塞或洗板機洗板頭位置錯誤

　　配置洗液的去離子水或蒸餾水被污染

　　終止液濃度不夠，沒有充分混勻，或終止液被污染

　　讀數(shù)時酶標(biāo)板底部有水蒸氣凝結(jié)

　　酶標(biāo)儀偏差

　　7、假陽性結(jié)果

　　實驗器具被污染

　　血清中出現(xiàn)纖維蛋白凝集

　　血清標(biāo)本中出現(xiàn)過多的紅細胞

　　血漿標(biāo)本處理不當(dāng)

　　標(biāo)本中含有灰塵、顆粒或細菌等

　　標(biāo)本被反復(fù)凍融

　　加標(biāo)本后進行不正確的振蕩

　　沿孔壁上加入標(biāo)本，加樣后出現(xiàn)過多的氣泡

　　酶標(biāo)滴加在孔壁上，洗板未洗凈

　　混用洗液或洗液稀釋錯誤

　　洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌

　　洗板次數(shù)不足或浸泡時間短

　　洗板時洗液量少或殘留量多

　　洗板時洗液量過多、串孔

　　讀數(shù)時酶標(biāo)板底部有水蒸氣凝結(jié)

　　洗液瓶、廢液瓶混用

　　讀數(shù)過程中板孔中有氣泡

　　酶標(biāo)儀偏差

　　8、同一板內(nèi)重復(fù)性差

　　標(biāo)本混勻不充分

　　試劑混勻不充分

　　標(biāo)本與酶結(jié)合物混勻不充分

　　加樣技術(shù)差異

　　加樣器故障或加樣器被污染

　　加樣時間過長導(dǎo)致孵育時間不同

　　孵育器內(nèi)部的溫度不一致，造成酶標(biāo)板孔間的孵育溫度差異

　　讀數(shù)時酶標(biāo)板孔間有氣泡

　　9、HCV血清本底高

　　靈敏度高

　　樣本稀釋液加液量不足100ul

　　槍頭深入血清過深，致使外壁沾有血清導(dǎo)致加樣偏多(>10ul)

　　同一孔加了兩次樣本

　　其他可能原因參考HBsAg

　　10、HIV陽性對照低

　　誤將陽性對照稀釋

　　陽性對照未混勻

　　加液量不足

　　其他可能原因參考HBsAg

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